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陈煜教授 | 非生物、生物与组织工程人工肝 :现状与展望

一、非生物型人工肝

 

非生物型人工肝是指通过机械、理化装置构成的支持系统来清除毒素,部分兼有补充体内重要物质和调节机体内环境的功能。主要包括血浆置换(Plasma Exchange, PE)、血液灌流(Hemoperfusiuon, HP)、血液滤过(Hemofiltration, HF)、血液透析(Hemodialysis, HD)等。

 

近年来,随着理论的不断更新以及技术的进步,人工肝治疗手段也发生了变化,将不同非生物型人工肝有效联合应用,利用其各自优势取长补短的治疗方法已经成为国内外研究的热点和新趋势。

 

一些非生物人工肝序贯治疗的方法,如血浆置换联合血浆灌流、血液透析/滤过联合血液灌流、血浆置换联合胆红素吸附等技术均已广泛开展。而像分子吸附再循环系统(Molecular Adsorbent Recirculating SystemMARS)、Prometheus系统、PDF等组合型非生物人工肝,其本身就结合了多种非生物型人工肝方法。

 

PE因其所需设备简单、操作方便、疗效显著、费用较低等优点成为目前国内人工肝治疗的主流模式。然而目前临床上人工肝治疗肝衰竭患者的数量在不断增加,对血浆的需求量也越来越大,血浆资源紧缺问题日益严重。

 

将不同的非生物人工肝治疗方式组合应用是目前人工肝治疗的趋势和热点。联合治疗在提高疗效的同时,还可以减少血浆的用量,缓解血浆资源紧缺的局面。此外,在PE治疗的基础上,兼顾血浆的可及性、患者基线胆红素水平、凝血功能及病情严重程度等情况,制定可调节的个体化的非生物人工肝治疗模式尤为重要。

 

非生物人工肝治疗系统发展至今,其安全性及耐受性已被证实。如何对非生物人工肝治疗进行优化,以进一步提高疗效、减少不良反应是今后重点研究的方向。比如人工肝治疗的时机、治疗的间隔、治疗方法和模式的选择、治疗的时间长短、血浆的置换量、置换液的配方和流量、序贯的方法和先后、组合模式的方法等等都需要优化。

 

当然,还包括非生物型人工肝治疗过程中抗凝剂的使用。人工肝治疗的基础是体外循环,在治疗过程中既要使用抗凝剂来防止管路凝血,又不能抗凝过度导致患者出血。用于非生物人工肝治疗时的抗凝方法很多,如普通肝素、低分子肝素、枸橼酸盐局部抗凝以及无肝素的盐水冲洗等。

 

由于不同非生物型人工肝治疗方式、时间、次数各不同,体外循环管路的生物相容性不同,并且肝衰竭患者患者往往有凝血机制的障碍,故应根据实际情况进行个体化抗凝。需要注意的是由于肝衰竭患者凝血状态变化的个体化差异突出,无论应用何种抗凝剂,尤其是治疗时间较长时,都应在治疗过程中严密动态监测凝血指标以保证治疗安全进行。

 

二、生物型人工肝

 

临床上使用生物型人工肝治疗肝衰竭已经取得了良好的成效,但生物型人工肝仍不能完全替代肝脏复杂的生理功能。而以培养肝细胞为基础的生物型人工肝不仅可以替代肝脏特异性的解毒功能,还同时具有物质代谢、生物合成转化以及分泌生长因子等功能,是未来人工肝发展的趋势。

 

生物人工肝主要由肝细胞、生物反应器以及体外循环装置三部分组成,其原理是通过体外循环装置将肝衰竭患者的血液或血浆引入生物反应器内,与其中包含的肝细胞进行物质交换发挥解毒、合成、分泌及代谢等作用。

 

肝细胞是生物型人工肝的关键组成部分,其来源主要包括以下几种:

 

人类原代肝细胞:人肝细胞是最理想的肝细胞源,但由于数量有限、不易获得以及体外培养难度较大等因素限制了人肝细胞的应用。

 

猪肝细胞:猪肝细胞具有包括氨代谢、细胞色素P450活性等在内的特异性肝细胞功能,与人肝细胞功能最为相近,并且猪肝细胞来源较广、体外培养较易等优势,使其成为目前生物型人工肝应用较多的一类生物材料,如Hepat-assistAMC-BALBLSS等肝脏支持系统,可见一些个案报道或小样本临床研究,但近年并未见到新的大规模临床试验。虽然目前并没见到感染猪源性逆转录病毒的报道,但由于免疫排斥反应和畜源性疾病感染风险等因素在一定程度上限制了其应用。

 

肝细胞株:肝细胞株的优势主要在于其无限增殖的能力以及体外培养时相对较好的耐受性,主要有两种获得途径,一种是通过基因工程建立人类永生化肝细胞株,另一种是从人类肝脏肿瘤细胞分化而得到。

 

干细胞:干细胞是一类具有自我复制更新和多向分化潜能的细胞,是很有希望的生物人工肝细胞来源,包括胚胎干细胞、诱导性多功能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)以及成人干细胞等。

 

目前应用干细胞的生物人工肝尚处于临床前期的研究阶段和个案报道。虽然以往的临床研究显示生物人工肝在一定程度上可以改善肝衰竭患者短期预后,但还需要大样本、多中心RCT研究以对其长期预后和安全性进一步评估。最近在美国进行的ELAD生物人工肝期临床对照研究,旨在评估ELAD系统对严重酒精性肝炎肝衰竭的疗效及安全性,结果未能达到至少三个月总体生存率显著改善的主要终点观察指标,提示生物人工肝研究的挑战性。

 

总之,关于生物人工肝细胞来源,优质的人源肝细胞是首选,干细胞转分化是研究热点,胎肝细胞较理想,但受伦理学限制不易大量获得,肿瘤来源肝细胞系虽可大量增殖,但功能下降,且有低致瘤风险,肝干细胞体外大量增殖并向肝细胞定向分化成为可能,但肝细胞成熟度及功能有待加强。

 

关于生物反应器,仿生三维培养肝细胞,功能明显强于二维培养;生物反应器平板单层扩增倍数有限,接触式(灌流床、悬浮培养)生物反应器成为发展的主流。胆管问题短板目前仍是生物人工肝无法解决的问题。

 

三、组织工程人工肝

 

组织工程是将工程学、材料学与生命科学的原则应用到开发生物代替物的前沿交叉学科领域,其核心内容是体外构建具有相应生物学功能的工程化组织。肝脏组织工程一直都是组织工程中的热点研究领域,近数十年来构建精确的体外人肝脏模型已成为学术界和工业研究人员努力的目标。

 

整个器官或组织的去细胞化产生可获取其中的细胞外基质从而用于移植和组织工程器官研究。这种技术使用清洁剂和脱脂剂去除来自宿主组织的细胞组分,同时保留三维(3-D)基质的脉管系统基质和器官特异性的支架成分。

 

去细胞化产生的具有化学组成的生物支架对于细胞存活、分化和功能发挥是非常重要的。保留尽可能多的细胞外基质及控制细胞行为生长因子的必要性被诸多去细胞方案所证实。通过优化去细胞技术获取去细胞支架,可以促进和调节细胞种植进而重组不同器官,同时因为保留氧和营养输送所需的脉管系统网络可以进行3-D组织代谢,从而获得功能性组织工程器官。

 

组织工程技术发展为制备具有活性的生物支架提供了可能,去细胞化技术近年来取得良好的成果,该技术可以最大程度地保留原始组织结构,不但有利于细胞的存活更有利于细胞发挥其功能。

 

北京佑安医院课题组联合国内专家在前期工作基础上,建立了一种全新而独特的肝脏去细胞技术,使用门静脉序贯灌注方法在大鼠麻醉状态下对其肝脏进行原位去细胞化处理,对获得的去细胞支架进行的一系列检测结果证实,通过门静脉灌注的方法可以获得去细胞化的肝脏支架。该肝脏支架在再细胞化过程中起到提供空间作用,以其独有的血管网络结构和三维培养细胞外基质为移植的细胞提供营养物质和氧分,从而大大改善了种植在其中的肝细胞的功能。

 

通过使用HepG2进行再细胞化,课题组建立了体外的组织工程肝脏模型,构建成体外的功能性组织工程肝脏,并对其肝功能及形态进行分析。结果证实通过门静脉灌注HepG2细胞的再细胞化方式是成功的,形态学显示细胞分散在支架内,细胞成片生长,绒毛发达,并建立了良好的细胞极性及紧密连接。

 

北京佑安医院联合课题组进一步研究构建了血管化的3D人体循环灌注肝脏模型,由实质(肝细胞)和非实质(HUVEC)细胞组成。HUVEC细胞在支架内培养一段时间后会自主迁徙到原血管所在的位置,形成管腔样结构。加入了内皮细胞的组织工程肝脏的功能,包括白蛋白、尿素的分泌,药物代谢酶的酶活性等都比单独的肝细胞再细胞化后构建的组织工程肝脏要优越很多。在内皮细胞的支持下,尤其药物代谢相关的酶活性及转运体等都明显提高。

 

小结

 

人工肝支持治疗系统自进入临床以来,已经成为治疗肝衰竭患者的重要手段。但其发展和临床应用仍有许多待解决的问题:

 

各种类型的非生物型人工肝能否提高肝衰竭患者的生存率尚存在争议,需要更多大规模的随机对照试验来验证。另外目前对于非生物人工肝远期疗效评价不一,也可能提示我们应该进一步提高其清除毒素、调节机体内环境的能力。

 

尚缺乏标准化的人工肝治疗模式,对于病因、病情程度各不相同的肝衰竭患者如何确定最佳的人工肝治疗方案,以达到成本效果最优化,需要更多的临床研究。

 

缺乏一个可靠的风险预测模型来判定人工肝治疗的最佳时机,即根据对肝衰竭患者预后的推测,决定患者是内科联合人工肝治疗还是及时准备肝移植手术。

 

非生物型人工肝目前仍然是临床上应用人工肝治疗肝衰竭的主要手段。但随着各学科领域的交叉发展,生物型人工肝、组织工程人工肝以及构建新型人工肝脏替代损伤肝脏等治疗手段必将取得进展,为肝衰竭的治疗提供行之有效的方法。

专家简介

陈煜

 

首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病与人工肝中心主任,主任医师、教授、博士生导师,中华医学会肝病学分会工作秘书及青年委员会副主任委员、重肝及人工肝学组副组长,北京医学会肝病学分会委员、肝衰竭及人工肝学组副组长,全国重型肝病及人工肝血液净化攻关协作组副组长,中国研究型医院学会肝病专业委员会重症肝病学组副组长,中国医师协会急救复苏专业委员会委员,北京医院协会医疗管理科学专业委员会委员,北京市科技新星,北京市卫生局十百千卫生百名人才,北京市卫生系统高层次卫生技术人才,北京市优秀人才,2015年度首都十大杰出青年医师。

 

《中华肝脏病杂志》、《临床肝胆病杂志》、《实用肝脏病杂志》、《北京医学》、《胃肠病与肝病杂志》审稿专家,曾在香港大学医学院、英国伦敦大学医学院做访问学者。长期从事重型肝病肝衰竭的应用基础及临床研究。参与举办第一届至第九届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会,参与《人工肝脏治疗学》、《实用人工肝治疗操作手册》、《实用SARS学》、《突发传染病防治教程》、《疑难重症肝病100例》、《全国肝病科普咨询专家规范化培训试题》、《传染病学》及英文版等多部著作的编写。承担国家自然科学基金、十一五十二五十三五肝炎重大专项等多项科研任务,参与科技部科技攻关引导项目、北京市科委科技重大项目、973项目、863项目等多项重大科研工作。近5年发表论文一百余篇,以第一或通讯作者发表SCI论文十余篇,获科技成果6项。

 

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创建时间:2018-10-22 15:12